拉曼激活細(xì)胞分選

如前所述，拉曼光譜是一種無損非標(biāo)記的單細(xì)胞表型識別手段，在基于微生物組或工程細(xì)胞庫的細(xì)胞功能篩選中均具有廣闊的應(yīng)用前期。如何在拉曼識別后高通量地分選目標(biāo)表型細(xì)胞，即拉曼激活細(xì)胞分選（Raman-activated cell sorting，RACS），并用于下游培養(yǎng)、組學(xué)分析等環(huán)節(jié)，對于細(xì)胞表型測試平臺的構(gòu)建同樣重要。近年來，一系列基于拉曼光譜的單細(xì)胞分選技術(shù)和核心器件先后面世，其中包括拉曼光鑷分選、拉曼彈射分選（RACE）、拉曼光鉗液滴分選（RAGE）、拉曼微流分選（RAMS）、拉曼微流液滴分選（RADS）等。這些新工具有效耦合了單細(xì)胞拉曼表型測量和基因型分析（或培養(yǎng)），為在單細(xì)胞水平解析表型和基因型的關(guān)系提供了重要手段。

拉曼激活彈射分選（RACE），其基本原理是在拉曼測量基片上濺射一層薄膜，將樣品點(diǎn)在該薄膜上并封裝接收微孔陣列；對細(xì)胞進(jìn)行拉曼檢測后，特定細(xì)胞可通過施加一束脈沖激光在目標(biāo)細(xì)胞位置的基體芯片上；該細(xì)胞將被彈射剝離到收集微孔內(nèi)，可靈活實(shí)現(xiàn)單個(gè)微孔內(nèi)收集單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。受光斑尺寸的影響，直接彈射一般用于小細(xì)胞的彈射分離，針對大細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，可對目標(biāo)細(xì)胞區(qū)域先進(jìn)行激光切割（RAMD），然后進(jìn)行彈射。該方法操作相對靈活簡單，分選準(zhǔn)確率高。然而，拉曼分析分選時(shí)的激光輻射對細(xì)胞的生理活性會(huì)造成一定損傷，而在?RACE?的干片模式下，導(dǎo)熱散熱較為困難，輻射造成的細(xì)胞活性損傷有可能更為顯著。此外，由于激光輻射引起胞內(nèi)核酸損傷等可能原因，彈射后細(xì)菌單細(xì)胞測序的覆蓋度一般不超過?20%，因此基因組拼裝相對困難。

拉曼激活光鑷液滴分選（RAGE），是筆者團(tuán)隊(duì)新近開發(fā)的一種耦合拉曼光鑷和液滴單細(xì)胞包裹導(dǎo)出的拉曼細(xì)胞分選技術(shù)。RAGE?克服了單一光鑷力難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞脫離焦平面導(dǎo)出的問題，通過耦合液滴微流控技術(shù)，完成了目標(biāo)單細(xì)胞的精準(zhǔn)分選和快速導(dǎo)出。同時(shí)，拉曼檢測于水相中進(jìn)行，能最大限度地保持細(xì)胞生理活性，并能夠精確匹配每個(gè)細(xì)胞與之相對應(yīng)的拉曼光譜表型，實(shí)現(xiàn)“所測即所得”。此外，分選后的單細(xì)胞已經(jīng)包裹在油包水微液滴中，因此可直接耦合后續(xù)的單細(xì)胞培養(yǎng)和組學(xué)分析。我們的數(shù)據(jù)表明，細(xì)菌細(xì)胞通過?RAGE?系統(tǒng)分選之后其存活率基本不受影響，可直接耦合下游的單細(xì)胞培養(yǎng)。而在與?RAGE?直接耦合的單細(xì)胞核酸擴(kuò)增與測序中，可能是由于液相拉曼檢測對于目標(biāo)細(xì)胞的保護(hù)作用，目標(biāo)大腸桿菌單細(xì)胞的全基因組測序覆蓋率有了大幅度提高（可達(dá)約?95%）。