野生型基因組清除技術(shù)

合成生物學(xué)目前尚未能完全從頭合成一個(gè)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能借用已有的宿主細(xì)胞。為獲得只含有人工合成基因組的生命體，需要采取一定的策略將野生型染色體清除。

基于負(fù)篩選的染色體清除策略

即使在人工染色體已經(jīng)植入宿主細(xì)胞并能發(fā)揮功能的情況下，對(duì)應(yīng)內(nèi)源染色體在自然狀態(tài)下丟失的概率依舊極低，需要通過篩選才有可能獲得這類細(xì)胞。Li等曾報(bào)道用正負(fù)篩選聯(lián)合的策略成功去除?21?三體綜合征患者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPSCs）中的一條?21?號(hào)染色體，使其核型恢復(fù)正常。他們把一個(gè)同時(shí)編碼負(fù)篩選標(biāo)記和正篩選標(biāo)記的雙功能融合基因敲入到?21?號(hào)染色體；通過正篩選獲得融合基因整合的細(xì)胞株，并從中進(jìn)一步篩選獲得融合基因單拷貝的細(xì)胞株；接著在無正篩選藥物的條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生攜帶融合基因的染色體丟失的細(xì)胞。由于負(fù)篩選基因能將無毒的負(fù)篩藥物轉(zhuǎn)化成有毒的物質(zhì)，進(jìn)而把宿主細(xì)胞殺死，故可以通過負(fù)篩選富集獲得一條?21?號(hào)染色體丟失的細(xì)胞株。通過正負(fù)篩選策略進(jìn)行合成染色體轉(zhuǎn)移后的內(nèi)源染色體的清除，需要依賴于首先將正負(fù)篩選融合基因插入指定的內(nèi)源染色體。近年來，基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展有望進(jìn)一步提升該策略的效率。

Cre-loxP?介導(dǎo)的染色體清除

Cre是一種重組酶，能識(shí)別?DNA?上的?loxP位點(diǎn)，并能根據(jù)兩個(gè)loxP?位點(diǎn)的排列方向?qū)⑵渲g的?DNA?片段進(jìn)行刪除、倒置等。此方法也可用于內(nèi)源染色體的清除。通過與鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）融合，人成體細(xì)胞細(xì)胞核可以被重編程，獲得多能性，但需要在重編程后將?ESC?來源的相關(guān)染色體清除。為達(dá)到此目的，Matsumura?等設(shè)計(jì)了一個(gè)基于?Cre-loxP重組系統(tǒng)的策略——CEC（chromosome elimination cassette）。CEC的中部攜帶一個(gè)熒光報(bào)告基因和一個(gè)抗藥篩選標(biāo)記，其兩端分別加入一個(gè)?loxP?位點(diǎn)，二者相向排列。Cre?介導(dǎo)的姐妹染色體重組，可以產(chǎn)生雙著絲粒染色體和無著絲粒染色體，此類異常染色體可在細(xì)胞分裂中被清除。然而，與基于正負(fù)篩選融合基因的策略類似，都需要事先對(duì)目標(biāo)染色體進(jìn)行相關(guān)基因的敲入操作。

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