基因編輯技術(shù)：進(jìn)展與挑戰(zhàn)
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TALENs?技術(shù)
ZFN?技術(shù)將基因編輯引領(lǐng)進(jìn)了不再單純依賴自然發(fā)生?DSBs?的時(shí)代，但其存在很大的局限性，如成本高、難以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯等。而?TALE（transcription activator like effector）基序的發(fā)現(xiàn)催生了第二代基因編輯技術(shù)——TALENs（TALE nucleases）。TALEN?的構(gòu)造與?ZFN?類(lèi)似，由?TALE?基序串聯(lián)成決定靶向性的?DNA?識(shí)別模塊，與?FokI?結(jié)構(gòu)域連接而成。與?ZF?基序不同，一個(gè)?TALE?基序識(shí)別一個(gè)堿基對(duì)（圖?1b），因此串聯(lián)的?TALE?基序與所識(shí)別的堿基對(duì)是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于相同的靶點(diǎn)?TALENs?有與?ZFNs?相同的切割效率，但是毒性通常比?ZFNs?的低，另外其構(gòu)建也比?ZFNs?容易。然而，TALENs?在尺寸上要比?ZFNs?大得多，而且有更多的重復(fù)序列，其編碼基因在大腸桿菌中組裝更加困難。
RNA引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)
CRISPR/Cas9??技術(shù)
CRISPR/Cas?系統(tǒng)原本是細(xì)菌和古菌進(jìn)化出來(lái)用于抵御外來(lái)病毒及質(zhì)粒?DNA?的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。II?型CRISPR/Cas?系統(tǒng)依賴于外源?DNA?片段在規(guī)律成簇的短間隔回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）位點(diǎn)整合，其經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄及剪切后產(chǎn)生短的?CRISPR RNAs（crRNAs），crRNA?與反式轉(zhuǎn)錄的?crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）退火結(jié)合，然后引導(dǎo)?Cas9（CRISPR associated protein 9，Cas9）蛋白介導(dǎo)序列特異性的外源?DNA?降解。Jinek?等發(fā)現(xiàn)?Cas9?發(fā)揮靶向切割作用所依賴的?crRNA?和?tracrRNA?可以融合為一體，作為?sgRNA（single guide RNA）（圖?1c）。隨后，若干研究組陸續(xù)報(bào)道?CRISPR/Cas9?系統(tǒng)可用于人類(lèi)細(xì)胞的靶向基因編輯。與?ZFNs?和?TALENs?技術(shù)相比，CRISPR/Cas9?的設(shè)計(jì)要簡(jiǎn)單得多，而且成本很低，對(duì)于相同的靶點(diǎn)，CRISPR/Cas9?有相當(dāng)甚至更好的靶向效率。